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Alentejo2020 Portugal2020 FEDER

Fase 5

 ANÁLISES LABORATORIAIS
 Tarefa 1: Análises químicas, físicas e sensoriais
 Data de início: 01/4/2016  Data de conclusão: 31/12/2018  Duração: 33 meses
 Objetivos, descrição da tarefa e resultados esperados

 

O objetivo desta tarefa é realizar os procedimentos analíticos para caracterizar a composição química das dietas experimentais, da carne, da gordura subcutânea, dos conteúdos do rúmen e do abomaso, bem como as determinar as características físicas e sensoriais da carne referentes aos ensaios de produção realizados com ovinos (Fase 3 ) e com bovinos (Fase 4).

Os alimentos serão analisados para avaliação da composição química conforme descrito na Fase 2.

Para a composição química da carne, as amostras Lt serão processadas para a determinação da matéria seca e cinzas. A extracção e metilação dos lípidos da gordura subcutânea e do músculo serão feitos como descreveu Francisco et al. (2015).

Os ácidos gordos dos conteúdos do rúmen e do abomaso serão determinados segundo o método descrito por Alves et al. (2013). A composição em ácidos gordos dos ésteres metílicos será determinada por cromatografia gasosa.

As amostras do músculo Ll esquerdo serão descongeladas durante 24 horas a 7 ˚C. O pH será medido utilizando um potenciómetro de penetração equipado com termómetro. As perdas por cozedura serão avaliadas pesando as amostras de músculo antes e após do processo de cozedura em forno elétrico até atingir uma temperatura interna de 70 °C. Serão preparadas sub-amostras do músculo Ll com 1 cm2 de secção para a determinação de força de corte utilizando um texturómetro equipado com Warner Bratzler. Para a avaliação da qualidade sensorial será utilizado um painel de provadores treinados com 10 elementos. As amostras do músculo Ll serão descongeladas durante 24 horas em condições de refrigeração (7 °C) e preparadas num forno elétrico até que a temperatura interna atinge 70 °C. Serão então preparadas sub-amostras com 1 cm3 que serão oferecidas aos membros do painel para avaliação da tenrura, suculência, flavor e aceitação global utilizando uma escala estruturada de 8 pontos.

Para a análise estatística, a unidade experimental será o parque. Os dados serão analisados utilizando Proc Mixed do SAS usando um modelo que incluirá a dieta como efeito principal e o animal como efeito aleatório. Para as variáveis (pH, cor, perda de cozimento, força de corte e características sensoriais), o modelo incluirá o tempo como efeito contínuo combinado com o efeito fixo da dieta e o efeito do animal como aleatório. Para os dados da análise sensorial, o efeito do provador será usado como bloco.

Esta tarefa será executada pela equipa do INIAV. Contamos com a colaboração da Faculdade de Medicina Veterinária para a interpretação dos resultados da cromatografia dos ácidos gordos nas pessoas do Professor Rui Bessa e da investigadora Susana Alves, técnicos com grande experiência nestas áreas e com quem mantivemos uma estreita colaboração em trabalhos anteriores.

Membros da equipa envolvidos nesta tarefa:

 

 

 Tarefa 2: Estado antioxidante dos animais e estabilidade oxidativa dos produtos
 Data de início 01/01/2017  Data de conclusão: 31/5/2018  Duração: 17 meses
Objetivos, descrição da tarefa e resultados esperados

 

A suplementação de dietas para ruminantes com gordura tem sido utilizada para aumentar a densidade energética e, mais recentemente, para melhorar o perfil de ácidos gordos dos seus produtos por inclusão de fontes de lípidos ricos em ácidos gordos polinsaturados. Estas estratégias nutricionais para promover o perfil de ácidos gordos dos produtos dos ruminantes é relevante do ponto de vista nutricional, mas a elevada suscetibilidade dos ácidos gordos polinsaturados à oxidação expõem os animais a condições de stress oxidativo, o que pode comprometer o seu estado de saúde e produtividade, enquanto aumenta o risco de oxidação dos produtos, reduzindo o seu tempo de conservação.

Resultados recentes mostraram que a inclusão de PDC em rações de borregos melhora a estabilidade oxidativa da carne durante o período de conservação, reduzindo a oxidação das frações lipídica e proteica (Inserra et al., 2014; Gravador et al., 2014). O ácido tânico também apresenta atividade antioxidante, e a sua efetividade para o controlo da oxidação lipídica foi recentemente demonstrada em tecidos de frangos alimentados com dietas suplementadas com ácido tânico (Starcevic et al., 2014). No entanto, os efeitos de PDC e ácido tânico na estabilidade oxidativa da carne de ruminantes produzidos sob condições pró-oxidativas induzidas por suplementação lipídica não foram ainda avaliados.

Nesta tarefa pretende-se avaliar se o estado antioxidante dos animais e a estabilidade oxidativa da carne são afetados pela substituição do cereal por PDC ou pela inclusão do ácido tânico em dietas pró-oxidantes. As determinações serão realizadas no músculo e no plasma recolhidos nos borregos e novihos (Fases 3 e 4). Para a avaliação do estado antioxidante geral dos animais, serão determinados dois biomarcadores de stress oxidativo diferentes no plasma, com base na determinação da oxidação de lípidos e a capacidade antioxidante total. O grau de oxidação lipídica no plasma será avaliado pela quantificação dos seus produtos de oxidação, medindo a formação de malondialdeído (MDA) através do método das substâncias reativas ao ácido 2-tiobarbiturico seguindo genericamente o procedimento descrito por Francisco et al. (2015) adaptado ao plasma. A avaliação da capacidade antioxidante será feita através de dois ensaios diferentes, poder antioxidante por redução do ião férrico (ensaio FRAP) e capacidade de eliminação de radicais (ABTS˚+ ensaio), seguindo os procedimentos descritos por Luciano et al. (2009).

Para a avaliação da estabilidade oxidativa da carne durante 7 dias de armazenagem (a preparação destas amostras foi descritas na fase 3 será determinada a intensidade da lipoperoxidação, medindo a formação de malondialdeído (MDA) seguindo o procedimento descrito por Francisco et al. (2015). Os resultados serão expressos em mg de malonaldeído (MDA)/kg de carne. Durante o período de conservação serão monitoradas as alterações da cor da carne, utilizando um colorímetro - Minolta CR300.

Esta tarefa será realizada pela equipa do CEBAL, e permitirá esclarecer se em condições pro-oxidantes, a eficácia da inclusão de DCP e de ácido tânico nas dietas para melhorar o status antioxidante dos borregos e novilhos e a estabilidade oxidativa das carnes, reduzindo a oxidação dos lípidos e alterações de cor indesejáveis.

Membros da equipa envolvidos nesta tarefa:

 

 

 Tarefa 3: Diversidade do microbioma ruminal
 Data de início 01/12/2017  Data de conclusão: 31/05/2018  Duração: 6 meses
 Objetivos, descrição da tarefa e resultados esperados

 

O objetivo desta tarefa é estudar as alterações na diversidade do microbioma do rúmen induzidas pela dieta em borregos e novilhos. O microbiota ruminal é extremamente complexo e variável e a maioria dos microrganismos que o integram não pode ser cultivado em condições de laboratório. Os avanços tecnológicos associados à biologia molecular e à bioinformática, principalmente no sequenciamento de DNA e na compilação das sequências obtidas em bancos de dados, permite que seja acessível a determinação do perfil do microbioma ruminal. A extensa acumulação de dados que se registou nas últimas duas décadas, permite à comunidade científica estabelecer um quadro mais geral dos principais fatores que determinam a composição da flora ruminal, bem como das suas funções.

Atendendo à especificidade dos equipamentos necessários, esta fase do projeto será conduzida recorrendo a uma aquisição de serviços a um laboratório especializado. Utilizar-se-ão técnicas moleculares para a amplificação do DNA dos microrganismos ruminais por PCR, seguidas de pirosequencião baseada na tecnologia de sequenciação do Illumina. Os dados obtidos serão comparados com as bases de dados disponíveis, utilizando a plataforma BLAST (Básico Local Alignment Search Tool), o que permitirá a identificação taxonómica das sequências analisadas.

Os estudos sobre o efeito da dieta sobre o microbioma ruminal têm mostrado grande variabilidade entre os indivíduos e, consequentemente, o número de repetições em cada estudo deve ser tão alto quanto possível (Firkins et al., 2006). Atendendo a isto, o protocolo de pirosequencião Illumina foi escolhido por apresentar, com um baixo custo e num curto período de tempo, um elevado rendimento de genes sequenciados a partir da região de rADN 16S de genomas dos ribossomas bacterianos. Esta técnica é amplamente utilizada para a identificação de bactérias e há uma grande quantidade de informação disponível sobre as sequências de bases de nucleótidos que constituem o rADN da subunidade 16S de ribossomas (Woo et al., 2012). Essas sequências estão presentes em todos os procariotas e são conservadoras embora o genoma de diferentes espécies e géneros de bactérias apresentem regiões em que a variação genética é muito elevada, o que lhe confere um grande poder de discriminação.

As amostras de conteúdo ruminal recolhidas durante o ensaio serão liofilizadas e submetidas a um processo de extração do ADN utilizando DNeasy Blood & Tissue kit (Qiagen®), de acordo com as instruções do fabricante. O grau de pureza e a quantidade de ADN obtido serão avaliados utilizando um Espectrofotómetro Nanodrop 2000c (Thermo Scientific). A concentração de ADN apresentada em cada amostra será ajustada para, aproximadamente, 20 ng /µL. Estes procedimentos serão realizados pela equipa do INIAV e as amostras serão enviadas para o laboratório de Scot Dowd "Laboratórios de Ensaio e Investigação, LLC - DNA MR" (Lubbock, Texas) (www.mr-dna.com) para pirosequenciação.

Os resultados das técnicas de pirosequenciação, o alinhamento das regiões 16S rDNA sequenciadas com as sequências de referência existentes na base de dados GenBank, utilizando a plataforma BLAST (Básico Local Alignment Search Tool), vão permitir o agrupamento das sequências analisadas em OTU (unidades taxonómicas operacionais). Em seguida, a análise da percentagem de identidade entre as sequências de referência e as obtidas conduzirá à compilação de OTU ao nível taxonómico mais relevante. Assim, a identificação de espécies bacterianas será feita quando a correspondência for superior a 97%; de géneros quando variar entre 95 e 97%; de famílias quando variar entre 95 - 90%; de ordens quando variar entre 85 - 90%; de classes, se variar entre 80 - 85%; e de filo quando variar entre 77 e 80%. Depois disso, os índices de diversidade microbiana serão computados e a abundância relativa dos diferentes níveis taxonómicos de bactérias será submetida a uma análise de variância para testar os efeitos de dietas e, utilizando modelos de regressão que permitam relacionar com os ácidos gordos sintetizados no processo de bioidrogenação.

Esta tarefa será da responsabilidade do INIAV. O processo de extração do DNA será executado no INIAV, que encaminhará as amostras para um laboratório especializado nos Estados Unidos da América.

Com os resultados desta tarefa esperamos encontrar alguma relação entre as dietas e a composição da flora microbiana, aprofundando os mecanismos associados à alteração da via normal de bioidrogenação para a via da síntese preferencial de C18:1 t10, que importa evitar.

Membros da equipa envolvidos nesta tarefa: