MerinoParasiteMerinoParasite
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    • Diagnóstico de Parasitoses
    • Análises Clínicas
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      • Telmo Nunes
      • Andreia J. Amaral
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Projeto Merino Parasite

Projeto: PTDC/CVT-CVT/28798/2017
Financiado por:

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Sobre o Projeto

merino

A raça Merina Branca é a raça ovina autóctone mais representativa em Portugal. A sua produção fornece produtos de qualidade aos consumidores, ajuda a manter a população nas zonas mais desfavorecidas do país e é essencial para a preservação do ambiente e da paisagem rural.

Os parasitas internos têm um grande impacto na indústria ovina em todo o mundo. Os custos do tratamento e as perdas de produção podem aumentar devido às alterações climáticas causadas pelo aquecimento global. A preocupação com a resistência aos anti-helmínticos, os resíduos nos produtos animais e no solo e as restrições ao uso de fármacos nas explorações orgânicas, exigem opções de controlo mais sustentáveis.

O melhoramento genético para a resistência aos parasitas é uma estratégia crucial no controlo integrado das parasitoses. A identificação de marcadores genéticos de resistência aos parasitas poderá constituir um instrumento de alto desempenho para a seleção dos animais. Esta abordagem ainda é pouco utilizada e nunca foi explorada em ovinos em Portugal.

O principal objetivo do projeto é, pois, identificar marcadores genéticos associados à resistência aos parasitas internos, com potencial aplicação no melhoramento genético desta raça. Isto será alcançado com um método inovador, baseada na tecnologia recente Illumina OvineHD Beadchip, que permite analisar as variações genéticas em mais de 600.000 SNP no genoma ovino em simultâneo.

Este projeto constitui também uma excelente oportunidade para estudar as espécies de parasitas que infetam a raça Merina Branca em diferentes áreas agroclimáticas e avaliar a resistência anti-helmíntica das espécies de parasitas com maior impacto na produção.

 

Tarefas

  1. Colheita de Amostras
  2. Diagnóstico de Parasitoses
  3. Análises Clínicas
  4. Resistência anti-helmíntica
  5. Genotipagem por Illumina HD Beadchip
  6. Análise GWAS e pós-GWAS
  7. Dados epidemiológicos
  8. Comunicação de resultados

Colheita de amostras de campo e recolha de dados

Tarefa 1

 

famacha

Esta tarefa envolve a colheita de amostras de campo e a recolha de dados epidemiológicos. Serão amostrados 30 animais em 35 explorações, perfazendo um total de 1050 amostras individuais. A amostragem será feita tendo em conta a distribuições geográfica das explorações, de forma a maximizar a probabilidade de capturar variações espaciais na distribuição das diferentes espécies de parasitas. A amostragem será preferencialmente realizada durante as intervenções realizadas pela ANCORME para registo dos animais no livro genealógico, de forma a evitar stress adicional aos animais.

As amostras de fezes (aproximadamente 15-20g) serão colhidas de borregos com idade entre 4 a 12 meses para tubos de colheita individuais e as amostras de sangue serão colhidas por punção venosa jugular em tubos de vácuo com K3EDTA. Todas as amostras serão refrigeradas até ao seu processamento. No momento da colheita das amostras, o estado de anemia dos animais será determinado pela escala FAMACHA©.

Durante as visitas às explorações será implementado um questionário aos produtores, através de uma aplicação online, para obter informações epidemiológicas: dados dos animais e do rebanho (sexo, idade, tamanho do rebanho), práticas de maneio (sistema de produção, utilização de anti-helmínticos) e dados de produtividade.

Instituições envolvidas e membros da equipa nesta tarefa:

INIAV

  • Helga Waap
  • Jacinto Gomes
  • Ana Júlia Afonso

FMV

  • Luís Telo Gama
  • Telmo Nunes

ANCORME

  • Tiago Perloiro
  • Ana Carrasco
  • Rafael Silva
  • Tiago Appleton
  • Filipa Taniças

Resultados esperados:

  • Obtenção de amostras de sangue e fezes para as tarefas subsequentes
  • Obtenção de dados epidemiológicos para estimar a prevalência, a distribuição espacial e os fatores de risco associados às diferentes espécies de parasitas
  • Hierarquização dos animais em função dos resultados obtidos para a escala de anemia FAMACHA© e o peso corporal (marcadores fenotípicos de resistência)

Diagnóstico qualitativo e quantitativo das espécies parasitárias nas explorações

Tarefa 2

 

Os ovinos podem estar infetados com várias espécies de nemátodes, céstodes e tremátodes. Estes parasitas infetam diferentes órgãos e tecidos. Os mais patogénicos e disseminados na Europa incluem os parasitas gastrointestinais Haemonchus contortus e Teladorsagia circumcincta, o parasita pulmonar Dictyocaulus filaria e o parasita hepático Fasciola hepatica. O diagnóstico dos parasitas internos em amostras fecais baseia-se em diferentes métodos coprológicos, que detetam fases específicas do ciclo de vida destes parasitas. A contagem de ovos nas fezes (FEC-Fecal Egg count) é o método mais comum utilizado para medir a resistência/suscetibilidade aos parasitas internos em ovinos. Animais com FEC mais baixos são considerados mais resistentes e há evidências que comprovam que esta característica é hereditária.

FlotacEsta tarefa englobará técnicas parasitológicas padronizados, assim como métodos serológicos e moleculares, quando aplicável, para identificar as diferentes espécies de parasitas envolvidas e quantificar os níveis de infeção.

Os diferentes métodos compreenderão: 1) a técnica de Baermann para deteção de larvas pulmonares; 2) técnicas de sedimentação e serológicas utilizando testes ELISA comerciais para o diagnóstico de Fasciola hepatica; e 3) técnicas de flutuação utilizando o aparelho Mini-Flotac® para diagnóstico e contagem de ovos de helmintas.

A FEC será utilizada como um marcador fenotípico de resistência. Além disso, as amostras fecais serão utilizadas em coproculturas, que permitirão a recuperação e identificação morfológica de larvas de terceiro estádio (L3). Os ovos e larvas de nemátodes gastrointestinais serão purificados e submetidos a extração de DNA para confirmação das espécies por PCR utilizando primers conhecidos. As análises parasitológicas, serológicas e moleculares serão realizadas no laboratório de parasitologia do INIAV.

Instituições envolvidas e membros da equipa nesta tarefa:

INIAV

  • Helga Waap
  • Jacinto Gomes
  • Ana Cristina Ferreira
  • Pedro Vieira (aluno de MIMV)
  • Ana Júlia Afonso

Università degli Studi di Napoli Federico II

  • Prof. Dr. Laura Rinaldi
    (Department of Veterinary Medicine and Animal Production)

Resultados esperados:

  • Identificação de parasitas que infetam os diferentes compartimentos do organismo dos ovinos.
  • Hierarquização dos animais em função dos resultados obtidos para a FEC (marcador fenotípico de resistência).
  • Obtenção de DNA de larvas/ovos de parasitas para determinação da resistência anti-helmíntica por pirosequenciação nas tarefas subsequentes.

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Determinação dos parâmetros hematológicos e bioquímicos

Tarefa 3

 

colheita sangue

Estudos prévios mostram que os parasitas internos causam distúrbios no sistema hematopoiético e danos severos na mucosa do fígado e do abomaso, causando anemia, diminuição das proteínas séricas e aumento das enzimas hepáticas. Vários parâmetros hematológicos e bioquímicos foram propostos como indicadores de resistência, mas a combinação dos diversos parâmetros poderá ser mais eficaz para determinar o estado de resistência ou suscetibilidade de uma raça específica.

Nesta tarefa, as amostras de sangue colhidas serão utilizadas para avaliar um painel de parâmetros hematológicos e bioquímicos associados à resistência aos parasitas. Os parâmetros hematológicos compreenderão a concentração de hemoglobina, o hematócrito, a contagem total de eritrócitos, a contagem total e diferencial de leucócitos e os parâmetros bioquímicos incluirão a determinação da concentração de proteína sérica total, albumina sérica, fosfatase alcalina, alanina aminotransferase e aspartato amino transferase.

Instituições envolvidas e membros da equipa tarefa:

INIAV

  • Ana Júlia Afonso

FMV

  • Maria Salomé Gonçalves
  • Pâmela Valente
  • Maria Alexandra Basso

Resultados esperados:

  • Hierarquização dos animais em função dos resultados obtidos para os parâmetros hematológicos e bioquímicos (marcadores fenotípicos de resistência)

Avaliação da resistência anti-helmíntica

Tarefa 4

 

Purificação de ovos de Parasitas
Pirosequenciador

O uso intensivo e indiscriminado de tratamentos profiláticos na produção pecuária levou ao desenvolvimento de resistência generalizada aos principais grupos de anti-helmínticos. Os benzimidazóis (BZ) estão entre os anti-helmínticos mais utilizados. Apesar de a resistência aos BZ ser um problema em ruminantes reconhecido mundialmente, especialmente em ovinos, não existem dados em Portugal. A resistência ao BZ em várias espécies de nemátodes gastrointestinais está correlacionada com três SNPs no gene da beta-tubulina nos codões F167Y, E198A e F200Y.

Este projeto permitirá analisar a resistência aos BZ em dois dos parasitas gastrointestinais mais patogénicos e prevalentes em ovinos na Europa, nomeadamente, Haemonchus contortus e Teladorsagia circumcincta. Presentemente, estão disponíveis ensaios de pirosequenciação para a análise quantitativa dos três SNPs, que serão utilizados neste estudo. Esta tarefa utilizará DNA extraído de ovos de parasitas gastrointestinais purificados e de larvas obtidas nas coproculturas.

Instituições envolvidas e membros da equipa nesta tarefa:

INIAV

  • Helga Waap
  • Ana Cristina Ferreira
  • Ana Júlia Afonso

Freie Universität Berlin - Institut für Parasitologie und Tropenveterinärmedizin

  • Prof. Dr. Georg von Samson-Himmelstjerna

Resultados esperados:

  • Determinação das frequências dos alelos da β-tubulina nos codões 167, 198 e 200 em H. contortus e T. circumcincta

Extração de DNA e genotipagem por Illumina OvineHD Beadchip

Tarefa 5

 

OvineHD Beadchip SNP50Esta tarefa compreenderá a extração de DNA e a genotipagem seletiva por Illumina HD Beadchip de um subconjunto de 400 borregos. Estes serão selecionados com base na análise estatística dos fenótipos relevantes (FEC, FAMACHA©, peso corporal e parâmetros hematológicos e bioquímicos) para representar os níveis extremos de resistência (alta e baixa) aos parasitas internos

Instituições envolvidas e membros da equipa nesta tarefa:

INIAV

  • Ana Júlia Afonso

FMV

  • Andreia J. Amaral

Resultados esperados:

  • Determinação do genótipo de 400 borregos para posterior análise GWAS e pós-GWAS.

Genome Wide Association Studies (GWAS) e análise pós-GWAS

Tarefa 6

 

marcadores dnaEsta tarefa visa identificar marcadores genéticos diretamente associados à variação fenotípica de resistência aos parasitas. A identificação dos marcadores genéticos ao nível dos 600 000 SNPs do OvineHD BeadChip array irá basear-se em métodos descritos, utilizando  ferramentas de análise de associação do genoma completo. As características de resistência aos parasitas serão analisadas utilizando o modelo misto de análise GEMMA (Genome-wide Efficient Mixed Model Analysis for Association Studies). Para corrigir a estratificação da população, será realizada uma análise de variância, onde o sexo, época de parto, parto simples ou múltiplo e a idade das mães serão ajustados como efeitos fixos e a idade como covariável linear.

A análise pós-GWAS irá centrar-se na pesquisa de genes próximos dos SNPs significativos. Como a maioria dos estudos de resistência aos nemátodes de ovinos utilizou marcadores de microssatélites, as posições dos respetivos pares de bases serão analisadas para comparação com as posições encontradas por Illumina OvineHD Beadchip. Além disso, o genoma de Bos taurus será pesquisado para homologias e genes nas regiões flanqueadoras dos SNPs de interesse. Com esta informação, iremos analisar potenciais vias biológicos para cada gene.

Instituições envolvidas e membros da equipa nesta tarefa:

INIAV

  • Helga Waap
  • Jacinto Gomes
  • Cristina Ferreira
  • Ana Júlia Afonso

FMV

  • Luís Telo Gama
  • Andreia J. Amaral

Resultados esperados:

  • Identificação de marcadores significativos de SNP correlacionados com características de resistência fenotípica
  • Identificação de genes candidatos
  • Identificação de vias biológicas envolvidas na resistência
  • Identificação dos tipos de tecidos envolvidos na expressão de genes candidatos

Análise dos dados epidemiológicos

Tarefa 7

 

georeferenciacaoO padrão de infeção e reinfeção parasitária é um fenómeno dinâmico que varia com a região geográfica, as condições do solo e do clima e o tipo de produção e sistema de pastoreio utilizados. As doenças parasitárias são ideais para aplicar as mais recentes tecnologias de geolocalização, uma vez que muitas espécies de parasitas estão confinadas a regiões específicas, caracterizadas por uma série de condições ambientais. O conhecimento da epidemiologia das diferentes espécies de parasitas, em particular a sua prevalência, distribuição geográfica, fatores de risco associados à exploração e condições edafoclimáticas, permitirá modelar espacialmente as zonas de risco para a ocorrência de determinados parasitas e ajudará a prever o melhor momento para a administração dos fármacos antiparasitárias e /ou adoção de medidas de maneio.

Nesta tarefa, os dados serão organizados numa base de dados específica e analisados por técnicas de análise univariada e multivariada, correlação e regressão logística, a fim de identificar os fatores de risco associados à infeção parasitária. Serão empregadas técnicas de análise de dados geográficos e dados remotos, a fim de os identificar fatores que possam influenciar a distribuição geográfica das diferentes espécies de parasitas. Os resultados dos modelos climáticos de potencial de transmissão das diferentes espécies de parasitas serão utilizados nos modelos espaciais, de forma a produzir mapas de risco de transmissão.

Instituições envolvidas e membros da equipa nesta tarefa:

INIAV

  • Helga Waap
  • Ana Júlia Afonso

FMV

  • Telmo Nunes

Resultados esperados:

  • Determinação da prevalência e distribuição geográfica das diferentes espécies de parasitas identificadas
  • Identificação de fatores de risco das parasitoses
  • Modelos e mapas preditivos de ocorrências das parasitoses

Disseminação e comunicação de resultados

Tarefa 8

 

Esta tarefa compreenderá o desenvolvimento, revisão e atualização de um plano anual de divulgação e comunicação para as atividades e resultados do projeto. Os grupos-alvo do projeto são vários, incluindo os produtores de ovinos da raça Merina Branca e outros, organizações de produtores pecuários, associações de criadores de ovinos, médicos veterinários e outros profissionais relacionados com o sector da produção animal, docentes e alunos de medicina veterinária e outras áreas relacionadas com produção animal, a indústria e o público geral.

A estratégia de comunicação levará em conta as diferentes necessidades de informação dos vários grupos-alvo. Os instrumentos de comunicação incluirão materiais de divulgação em suporte físico e eletrónico.

Instituições envolvidas e membros da equipa nesta tarefa:

INIAV

  • Helga Waap
  • Jacinto Gomes
  • Ana Cristina Ferreira
  • Ana Júlia Afonso

FMV

  • Luís Telo Gama
  • Telmo Nunes
  • Andreia J. Amaral

ANCORME

  • Tiago Perloiro

rebanhoResultados esperados:

Esta tarefa assegurará a comunicação das atividades e resultados do projeto a um público amplo, incentivando o diálogo entre os diferentes grupos-alvo e a colaboração científica, contribuindo assim para a consolidação do projeto e a melhoria da qualidade da investigação. Os meios de divulgação incluirão:

  • A publicação dos resultados em revistas científicas internacionais de acesso aberto;
  • A apresentação do projeto, atividades, objetivos e resultados em revistas para o setor de produção animal;
  • A publicação de um Manual de Boas Práticas para o controle sustentável de parasitas em explorações de ovinos, com foco especial na seleção genética;
  • Teses de mestrado e doutoramento;
  • A organização / participação em workshops para agricultores;
  • Apresentações em congressos e conferências científicas nacionais e internacionais;
  • A criação de um Website sobre as atividades e resultados do projeto.

Notícias do projeto

Merino Parasite presente na conferência COST-COMBAR
Publicado em 10-04-2022
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Estágios de Mestrado no projeto Merino Parasite
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Merino Parasite presente nas 13ª Jornadas do Hospital Veterinário Muralha de Évora
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Membros da equipa do projecto MERINO PARASITE participaram nas 13ª Jornadas do Hospital Veterinário ...

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Equipa

Helga Waap

ver

Jacinto Gomes

ver

Ana Cristina Ferreira

ver

Ana Júlia Afonso

ver

Colaboradores

Luís Telo da Gama

ver

Telmo Nunes

ver

Andreia J. Amaral

ver

Tiago Perloiro

ver

 

Colaboração de entidades externas

 

 

Prof. Dr. Georg von Samson-Himmelstjerna
Freie Universität Berlin
Institut für Parasitologie und Tropenveterinärmedizin
Robert-von-Ostertag-Str. 7-13
14163 Berlin, Germany

Prof. Dr. Laura Rinaldi
Department of Veterinary Medicine and Animal Production
Via della Veterinaria, 1
80137 Napoli, Italy

 

 

Larva de Dictyocaulus filaria

 

 

Ovos de estrongilídeos gastrointestinais contendo larvas L1

©2019 copyright: INIAV, I.P.
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