Colheita de amostras de campo e recolha de dados
Tarefa 1
Esta tarefa envolve a colheita de amostras de campo e a recolha de dados epidemiológicos. Serão amostrados 30 animais em 35 explorações, perfazendo um total de 1050 amostras individuais. A amostragem será feita tendo em conta a distribuições geográfica das explorações, de forma a maximizar a probabilidade de capturar variações espaciais na distribuição das diferentes espécies de parasitas. A amostragem será preferencialmente realizada durante as intervenções realizadas pela ANCORME para registo dos animais no livro genealógico, de forma a evitar stress adicional aos animais.
As amostras de fezes (aproximadamente 15-20g) serão colhidas de borregos com idade entre 4 a 12 meses para tubos de colheita individuais e as amostras de sangue serão colhidas por punção venosa jugular em tubos de vácuo com K3EDTA. Todas as amostras serão refrigeradas até ao seu processamento. No momento da colheita das amostras, o estado de anemia dos animais será determinado pela escala FAMACHA©.
Durante as visitas às explorações será implementado um questionário aos produtores, através de uma aplicação online, para obter informações epidemiológicas: dados dos animais e do rebanho (sexo, idade, tamanho do rebanho), práticas de maneio (sistema de produção, utilização de anti-helmínticos) e dados de produtividade.
Instituições envolvidas e membros da equipa nesta tarefa:
ANCORME
- Ana Carrasco
- Rafael Silva
- Tiago Appleton
- Filipa Taniças
Resultados esperados:
- Obtenção de amostras de sangue e fezes para as tarefas subsequentes
- Obtenção de dados epidemiológicos para estimar a prevalência, a distribuição espacial e os fatores de risco associados às diferentes espécies de parasitas
- Hierarquização dos animais em função dos resultados obtidos para a escala de anemia FAMACHA© e o peso corporal (marcadores fenotípicos de resistência)
Diagnóstico qualitativo e quantitativo das espécies parasitárias nas explorações
Tarefa 2
Os ovinos podem estar infetados com várias espécies de nemátodes, céstodes e tremátodes. Estes parasitas infetam diferentes órgãos e tecidos. Os mais patogénicos e disseminados na Europa incluem os parasitas gastrointestinais Haemonchus contortus e Teladorsagia circumcincta, o parasita pulmonar Dictyocaulus filaria e o parasita hepático Fasciola hepatica. O diagnóstico dos parasitas internos em amostras fecais baseia-se em diferentes métodos coprológicos, que detetam fases específicas do ciclo de vida destes parasitas. A contagem de ovos nas fezes (FEC-Fecal Egg count) é o método mais comum utilizado para medir a resistência/suscetibilidade aos parasitas internos em ovinos. Animais com FEC mais baixos são considerados mais resistentes e há evidências que comprovam que esta característica é hereditária.
Esta tarefa englobará técnicas parasitológicas padronizados, assim como métodos serológicos e moleculares, quando aplicável, para identificar as diferentes espécies de parasitas envolvidas e quantificar os níveis de infeção.
Os diferentes métodos compreenderão: 1) a técnica de Baermann para deteção de larvas pulmonares; 2) técnicas de sedimentação e serológicas utilizando testes ELISA comerciais para o diagnóstico de Fasciola hepatica; e 3) técnicas de flutuação utilizando o aparelho Mini-Flotac® para diagnóstico e contagem de ovos de helmintas.
A FEC será utilizada como um marcador fenotípico de resistência. Além disso, as amostras fecais serão utilizadas em coproculturas, que permitirão a recuperação e identificação morfológica de larvas de terceiro estádio (L3). Os ovos e larvas de nemátodes gastrointestinais serão purificados e submetidos a extração de DNA para confirmação das espécies por PCR utilizando primers conhecidos. As análises parasitológicas, serológicas e moleculares serão realizadas no laboratório de parasitologia do INIAV.
Instituições envolvidas e membros da equipa nesta tarefa:
INIAV
- Pedro Vieira (aluno de MIMV)
Università degli Studi di Napoli Federico II
- Prof. Dr. Laura Rinaldi
(Department of Veterinary Medicine and Animal Production)
Resultados esperados:
- Identificação de parasitas que infetam os diferentes compartimentos do organismo dos ovinos.
- Hierarquização dos animais em função dos resultados obtidos para a FEC (marcador fenotípico de resistência).
- Obtenção de DNA de larvas/ovos de parasitas para determinação da resistência anti-helmíntica por pirosequenciação nas tarefas subsequentes.
Determinação dos parâmetros hematológicos e bioquímicos
Tarefa 3
Estudos prévios mostram que os parasitas internos causam distúrbios no sistema hematopoiético e danos severos na mucosa do fígado e do abomaso, causando anemia, diminuição das proteínas séricas e aumento das enzimas hepáticas. Vários parâmetros hematológicos e bioquímicos foram propostos como indicadores de resistência, mas a combinação dos diversos parâmetros poderá ser mais eficaz para determinar o estado de resistência ou suscetibilidade de uma raça específica.
Nesta tarefa, as amostras de sangue colhidas serão utilizadas para avaliar um painel de parâmetros hematológicos e bioquímicos associados à resistência aos parasitas. Os parâmetros hematológicos compreenderão a concentração de hemoglobina, o hematócrito, a contagem total de eritrócitos, a contagem total e diferencial de leucócitos e os parâmetros bioquímicos incluirão a determinação da concentração de proteína sérica total, albumina sérica, fosfatase alcalina, alanina aminotransferase e aspartato amino transferase.
Instituições envolvidas e membros da equipa tarefa:
FMV
- Maria Salomé Gonçalves
- Pâmela Valente
- Maria Alexandra Basso
Resultados esperados:
- Hierarquização dos animais em função dos resultados obtidos para os parâmetros hematológicos e bioquímicos (marcadores fenotípicos de resistência)
Avaliação da resistência anti-helmíntica
Tarefa 4
O uso intensivo e indiscriminado de tratamentos profiláticos na produção pecuária levou ao desenvolvimento de resistência generalizada aos principais grupos de anti-helmínticos. Os benzimidazóis (BZ) estão entre os anti-helmínticos mais utilizados. Apesar de a resistência aos BZ ser um problema em ruminantes reconhecido mundialmente, especialmente em ovinos, não existem dados em Portugal. A resistência ao BZ em várias espécies de nemátodes gastrointestinais está correlacionada com três SNPs no gene da beta-tubulina nos codões F167Y, E198A e F200Y.
Este projeto permitirá analisar a resistência aos BZ em dois dos parasitas gastrointestinais mais patogénicos e prevalentes em ovinos na Europa, nomeadamente, Haemonchus contortus e Teladorsagia circumcincta. Presentemente, estão disponíveis ensaios de pirosequenciação para a análise quantitativa dos três SNPs, que serão utilizados neste estudo. Esta tarefa utilizará DNA extraído de ovos de parasitas gastrointestinais purificados e de larvas obtidas nas coproculturas.
Instituições envolvidas e membros da equipa nesta tarefa:
INIAV
Freie Universität Berlin - Institut für Parasitologie und Tropenveterinärmedizin
- Prof. Dr. Georg von Samson-Himmelstjerna
Resultados esperados:
- Determinação das frequências dos alelos da β-tubulina nos codões 167, 198 e 200 em H. contortus e T. circumcincta
Extração de DNA e genotipagem por Illumina OvineHD Beadchip
Tarefa 5
Esta tarefa compreenderá a extração de DNA e a genotipagem seletiva por Illumina HD Beadchip de um subconjunto de 400 borregos. Estes serão selecionados com base na análise estatística dos fenótipos relevantes (FEC, FAMACHA©, peso corporal e parâmetros hematológicos e bioquímicos) para representar os níveis extremos de resistência (alta e baixa) aos parasitas internos
Instituições envolvidas e membros da equipa nesta tarefa:
INIAV
FMV
Resultados esperados:
- Determinação do genótipo de 400 borregos para posterior análise GWAS e pós-GWAS.
Genome Wide Association Studies (GWAS) e análise pós-GWAS
Tarefa 6
Esta tarefa visa identificar marcadores genéticos diretamente associados à variação fenotípica de resistência aos parasitas. A identificação dos marcadores genéticos ao nível dos 600 000 SNPs do OvineHD BeadChip array irá basear-se em métodos descritos, utilizando ferramentas de análise de associação do genoma completo. As características de resistência aos parasitas serão analisadas utilizando o modelo misto de análise GEMMA (Genome-wide Efficient Mixed Model Analysis for Association Studies). Para corrigir a estratificação da população, será realizada uma análise de variância, onde o sexo, época de parto, parto simples ou múltiplo e a idade das mães serão ajustados como efeitos fixos e a idade como covariável linear.
A análise pós-GWAS irá centrar-se na pesquisa de genes próximos dos SNPs significativos. Como a maioria dos estudos de resistência aos nemátodes de ovinos utilizou marcadores de microssatélites, as posições dos respetivos pares de bases serão analisadas para comparação com as posições encontradas por Illumina OvineHD Beadchip. Além disso, o genoma de Bos taurus será pesquisado para homologias e genes nas regiões flanqueadoras dos SNPs de interesse. Com esta informação, iremos analisar potenciais vias biológicos para cada gene.
Instituições envolvidas e membros da equipa nesta tarefa:
INIAV
Resultados esperados:
- Identificação de marcadores significativos de SNP correlacionados com características de resistência fenotípica
- Identificação de genes candidatos
- Identificação de vias biológicas envolvidas na resistência
- Identificação dos tipos de tecidos envolvidos na expressão de genes candidatos
Análise dos dados epidemiológicos
Tarefa 7
O padrão de infeção e reinfeção parasitária é um fenómeno dinâmico que varia com a região geográfica, as condições do solo e do clima e o tipo de produção e sistema de pastoreio utilizados. As doenças parasitárias são ideais para aplicar as mais recentes tecnologias de geolocalização, uma vez que muitas espécies de parasitas estão confinadas a regiões específicas, caracterizadas por uma série de condições ambientais. O conhecimento da epidemiologia das diferentes espécies de parasitas, em particular a sua prevalência, distribuição geográfica, fatores de risco associados à exploração e condições edafoclimáticas, permitirá modelar espacialmente as zonas de risco para a ocorrência de determinados parasitas e ajudará a prever o melhor momento para a administração dos fármacos antiparasitárias e /ou adoção de medidas de maneio.
Nesta tarefa, os dados serão organizados numa base de dados específica e analisados por técnicas de análise univariada e multivariada, correlação e regressão logística, a fim de identificar os fatores de risco associados à infeção parasitária. Serão empregadas técnicas de análise de dados geográficos e dados remotos, a fim de os identificar fatores que possam influenciar a distribuição geográfica das diferentes espécies de parasitas. Os resultados dos modelos climáticos de potencial de transmissão das diferentes espécies de parasitas serão utilizados nos modelos espaciais, de forma a produzir mapas de risco de transmissão.
Instituições envolvidas e membros da equipa nesta tarefa:
Resultados esperados:
- Determinação da prevalência e distribuição geográfica das diferentes espécies de parasitas identificadas
- Identificação de fatores de risco das parasitoses
- Modelos e mapas preditivos de ocorrências das parasitoses
Disseminação e comunicação de resultados
Tarefa 8
Esta tarefa compreenderá o desenvolvimento, revisão e atualização de um plano anual de divulgação e comunicação para as atividades e resultados do projeto. Os grupos-alvo do projeto são vários, incluindo os produtores de ovinos da raça Merina Branca e outros, organizações de produtores pecuários, associações de criadores de ovinos, médicos veterinários e outros profissionais relacionados com o sector da produção animal, docentes e alunos de medicina veterinária e outras áreas relacionadas com produção animal, a indústria e o público geral.
A estratégia de comunicação levará em conta as diferentes necessidades de informação dos vários grupos-alvo. Os instrumentos de comunicação incluirão materiais de divulgação em suporte físico e eletrónico.
Instituições envolvidas e membros da equipa nesta tarefa:
Resultados esperados:
Esta tarefa assegurará a comunicação das atividades e resultados do projeto a um público amplo, incentivando o diálogo entre os diferentes grupos-alvo e a colaboração científica, contribuindo assim para a consolidação do projeto e a melhoria da qualidade da investigação. Os meios de divulgação incluirão:
- A publicação dos resultados em revistas científicas internacionais de acesso aberto;
- A apresentação do projeto, atividades, objetivos e resultados em revistas para o setor de produção animal;
- A publicação de um Manual de Boas Práticas para o controle sustentável de parasitas em explorações de ovinos, com foco especial na seleção genética;
- Teses de mestrado e doutoramento;
- A organização / participação em workshops para agricultores;
- Apresentações em congressos e conferências científicas nacionais e internacionais;
- A criação de um Website sobre as atividades e resultados do projeto.
