• Determinação das melhores condições de produção e purificação das VLPs em termos de rendimento e custos de produção;

O processo de produção e purificação das VP60-VLPs de RHDV2 foi desenhado de modo a gerar preparados vacinais em quantidade suficiente e qualidade aceitável para a realização de testes em modelos animais. É esperado que se alcance uma redução dos custos na produção através da simplificação do processo produção, do processo de purificação das VLPs, nomeadamente pelo menor requisito de pureza quando comparado com vacinas humanas, e pela elevada imunogenicidade destas partículas.

• Obtenção de VLPs

A obtenção das VLPs em quantidade suficiente é um resultado absolutamente crítico para o desenvolvimento das restantes etapas do projeto. Nesse sentido, estão pensadas estratégias que garantam o sucesso desta fase.

Uma vez obtidas, as VP60-VLPs de RHDV2 candidatas a vacina serão submetidas a uma avaliação da estrutura e funcionalidade, assim como da sua estabilidade após sujeição a diferentes condições de temperatura, humidade e liofilização.

• Desenvolvimento de ELISA indireta para deteção de anticorpos para RHDV2

As proteínas VLP recombinantes serão usadas para desenvolver um ELISA indireto (I-ELISA). Na ausência de um teste comercial, o desenvolvimento deste teste é essencial uma vez que permitirá, por um lado, avaliar a presença de anticorpos para RHDV2 antes da administração oral das VLPs aos animais de experimentação e, por outro lado, seguir/ estudar/ avaliar a resposta imunológica dos coelhos à ingestão oral das VLPs.

• Determinação da dose de VLPs (em µg) necessária para a imunização oral de coelhos domésticos e de coelhos-bravos.

É esperado que, no final da fase de experimentação animal em condições de laboratório, se tenha determinado a dose imunogénica de VLPs necessária para a imunização de coelhos-bravos.

Na impossibilidade de o fazer “in vitro”, a capacidade das VP60-VLPs de RHDV2 purificadas induzirem uma resposta humoral protetora contra o vírus da doença hemorrágica de tipo 2 (RHDV2) será avaliada in vivo através de contraprova. Toda a fase de experimentação animal será conduzida de acordo com os regulamentos nacionais para animais para fins experimentais (DL 113/2013, de 7 de agosto). No arranque desta fase, será realizado um teste piloto, em condições de laboratório, em coelhos domésticos SPF para determinar a quantidade mínima de proteína viral para induzir a produção de elevados títulos de anticorpos. Uma vez determinada a dose imunogénica de VLPs, a experimentação será estendida ao coelho-bravo, também em condições de laboratório.

• Determinação da capacidade imunogénica e protetora das VLPs

No decurso deste projeto é esperado que se determine, e se conheça em detalhe, a capacidade imunogénica e protetora das VP60-VLPs de RHDV2.

A proteção imunológica será avaliada realizando contra-prova em 50% dos animais, que serão inoculados com uma estirpe virulenta de RHDV2. A contra-prova será realizada em condições de laboratório.

A duração da imunidade induzida pela vacinação oral será monitorizada durante 6 meses nos outros 50% dos animais, permitindo avaliar a influência de uma possível heterogeneidade da ingestão do isco (ração contendo a vacina) na eficiência da imunização e na duração da imunidade.

• Obtenção de um protótipo da vacina

O resultado final esperado será a obtenção de um protótipo da vacina patenteável.