TAREFAS DO PROJETO
Foto:iBET
Construção de plasmídeo recombinante contendo o gene vp60 de RHDV2.
A equipa do projeto descodificou a informação genética das estirpes de RHDV2 para melhor compreender evolução do vírus, essencial para o desenvolvimento de uma vacina oral eficaz contra a DHV dos coelhos. Foi construído um banco de sequências de RHDV2 obtidas a partir de animais diagnosticados doentes, desde 2013, e no âmbito dos projetos “+ Coelho”, desde meados de 2017.
Nesta atividade são construídos vários plasmídeos recombinantes que integram o gene vp60 de um subconjunto de estirpes, representativas dos vírus que circulam no campo.
Neste plasmídeo, o gene vp60 está flanqueado por regiões conservadas no baculovirus.
Quando as células de inseto são simultaneamente transfectadas por estes plasmídeos e por DNA de baculovirus, são gerados virus recombinantes resultantes de recombinação homologa entre as regiões presentes no DNA plasmidico e viral.
O sistema permite apenas a multiplicação dos vírus recombinantes, uma vez que o DNA de baculovirus não possui um gene essencial, que é recuperado caso ocorra recombinação.
O objetivo da Atividade 1 será a construção bem-sucedida de um plasmídeo recombinante contendo o gene vp60 de estirpes de RHDV2 selecionadas.
Parceiros: INIAV - IBET
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Construção de plasmídeo recombinante contendo o gene vp60 de RHDV2.
A equipa do projeto descodificou a informação genética das estirpes de RHDV2 para melhor compreender evolução do vírus, essencial para o desenvolvimento de uma vacina oral eficaz contra a DHV dos coelhos. Foi construído um banco de sequências de RHDV2 obtidas a partir de animais diagnosticados doentes, desde 2013, e no âmbito dos projetos “+ Coelho”, desde meados de 2017.
Nesta atividade são construídos vários plasmídeos recombinantes que integram o gene vp60 de um subconjunto de estirpes, representativas dos vírus que circulam no campo.
Neste plasmídeo, o gene vp60 está flanqueado por regiões conservadas no baculovirus.
Quando as células de inseto são simultaneamente transfectadas por estes plasmídeos e por DNA de baculovirus, são gerados virus recombinantes resultantes de recombinação homologa entre as regiões presentes no DNA plasmidico e viral.
O sistema permite apenas a multiplicação dos vírus recombinantes, uma vez que o DNA de baculovirus não possui um gene essencial, que é recuperado caso ocorra recombinação.
O objetivo da Atividade 1 será a construção bem-sucedida de um plasmídeo recombinante contendo o gene vp60 de estirpes de RHDV2 selecionadas.
Parceiros: INIAV - IBET
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Produção e purificação de VP60-VLPs de RHDV2 e sua avaliação estrutural e funcional.
Para produção das VLPs, os baculovírus recombinantes são multiplicados em células de insecto onde ocorrem as modificações pós-traducionais necessárias para gerar VP60-VLPs imunológicas ativas.
O parceiro iBET montará uma plataforma de baixo custo para produção e purificação de VP60-VLPs em quantidade e qualidade suficientes para os estudos de imunização subsequentes.
A similaridade morfológica das VLPs com os viriões nativos será confirmada por microscopia eletrônica. A capacidade do VP60-VLPs de aglutinar os eritrócitos do grupo humano O (necessária para a construção de curvas cinéticas de seroconversão) será avaliada durante esta atividade. As VP60-VLPs serão testadas quanto à sua capacidade de serem reconhecidas por um soro anti-RHDV2 por Western blot.
O Objetivo da Atividade 2 é a produção e purificação de VP60-VPLs de RHDV2, necessárias para o desenvolvimento das atividades.
Parceiros: INIAV - IBET
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Produção de soro imune contra RHDV2 em coelho doméstico usando vacinas comerciais; implementação do teste Inibição da Hemaglutinação HI (de acordo com o manual da OIE) e desenvolvimento de um ELISA indireto (I-ELISA) para a deteção específica de anticorpos anti-RHDV2 desenvolvidos em coelhos inoculados por via oral.
Nesta atividade, serão produzidos soros imunológicos de coelho anti-RHDV2 e anti-RHDV imunizando coelhos domésticos com vacinas comerciais inativadas. Serão recolhidas e testadas amostras de sangue antes da imunização.
O teste de inibição da hemaglutinação (HI) será realizado de acordo com o manual da OIE.
O antígeno será preparado a partir de fígado de coelhos infectados. O procedimento padrão recomendado pelo Manual Terrestre da OIE será seguido.
As VP60-VLPs obtidas na Atividade 2 serão usadas para desenvolver um ELISA indireto (I-ELISA) para permitir o seguimento da resposta imunológica nos coelhos. O I-ELISA é mais prático e robusto do que o teste HI, e permitirá a construção das curvas de seroconversão para os animais inoculados por via oral.
Os resultados obtidos com este I-ELISA serão comparados com os obtidos com o teste HI.
O objetivo 1 da Atividade 3 é a obtenção de soro policlonal anti-RHDV2 produzido em coelho doméstico, necessário para desenvolver testes serológicos.
O objetivo 2 da Atividade 3 é o desenvolvimento de um teste ELISA indireto que será usado para determinar as curvas de anticorpos após a vacinação oral.
O objetivo 3 da Atividade 3 é a implementação do teste HI no INIAV, de acordo com as instruções da OIE.
Parceiros: INIAV
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Avaliação da resistência das VP60-VLPs à temperatura, humidade e liofilização.
A estabilidade das VP60-VLPs ao calor e à humidade será avaliada.
O objetivo da Atividade 4 é a determinação da resistência dos VP60-VLPs às condições ambientais.
Parceiros: INIAV
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Teste da via oral de imunização com a vacina contra RHDV2 baseada em VP60-VLPs em coelhos domésticos e selvagens; contraprova com vírus infecioso para avaliar a proteção imunológica conferida pela vacina.
A capacidade das VP60-VLPs de RHDV2 para induzir uma resposta humoral protetora contra o RHDV2 virulento será testada in vivo na FMV. As experiências serão conduzidas de acordo com os regulamentos nacionais para animais para fins experimentais (DL 113/2013, de 7 de agosto).
As propriedades imunogénicas das VP60-VLPs de RHDV2 serão testadas inicialmente em coelhos domésticos SPF para reduzir variáveis externas. Uma vez confirmada a dose imunogénica das VLPs para coelhos domésticos, os coelhos-bravos serão vacinados por via oral usando o mesmo procedimento.
Amostras de sangue serão coletadas e testadas para anticorpos contra RHDV2 pelos testes de HI e ELISA indireto (desenvolvido neste projeto). As curvas de seroconversão obtidas com ambos os testes serão comparadas e correlacionadas.
Será realizada contraprova de coelhos imunizados por via oral com uma estipe virulenta de RHDV2. A dose infeciosa será determinada.
No final desta atividade, os animais serão necropsiados e submetidos a exame histopatológico e testados para a presença de RNA de RHDV2 por RT-qPCR.
O objetivo da Atividade 5 é a obtenção das curvas de seroconversão em coelhos domésticos e em coelhos-bravos imunizados por via oral, bem como a eficácia da proteção imunológica induzida pela vacina na contra-prova com estirpes de campo de RHDV2.
Parceiros: INIAV - FMV/ULisboa
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Teste vacina oral contra o RHDV2 em coelho-bravo em condições de cercado; contraprova com estirpe virulenta de RHDV2.
Esta atividade tem como objetivo produzir informação sobre o consumo no campo por coelhos selvagens do isco/ração contendo a vacina; e sobre a eficácia da via oral na indução da proteção de anticorpos contra o RHDV2.
A experiência será estendida a um grupo de coelhos-bravos em condições de cercado sob a supervisão da Universidade de Évora. Coelhos-bravos serão adquiridos em centros de reprodução e submetidos a quarentena após triagem de anticorpos RHDV e RHDV2 e presença de RNA viral no sangue e fezes. Cada animal será identificado por um brinco.
As experiências serão conduzidas de acordo com os regulamentos nacionais para animais para fins experimentais (DL 113/2013, de 7 de agosto).
Para incentivar a ingestão do isco/ração contendo a vacina, será oferecida aos coelhos uma alimentação altamente palatável. O consumo do isco/ração será monitorizado 24h.
Os animais serão protegidos de artrópodes vetores através da aplicação regular de fármacos antiparasitárias “spoton”.
A proteção imunológica será avaliada realizando contraprova em 50% dos animais, que serão inoculados com uma estirpe virulenta de RHDV2. A contraprova será realizado em condições de laboratório.
A duração da imunidade induzida pela vacinação oral será seguida por até 6 meses nos outros 50% dos animais. Isso permitirá avaliar a influência de uma possível heterogeneidade da ingestão do isco/ reção contendo a vacina na eficiência da imunização e na duração da imunidade.
Os anticorpos também serão investigados em amostras fecais por I-ELISA.
Todos os animais serão necropsiados. O exame histopatológico e virológico será realizado no FMV e INIAV. O exame virológico incluirá a deteção de RHDV e RHDV2 pelos métodos moleculares RT-qPCR.
O objetivo da Atividade 6 é avaliar a apetência dos coelhos-bravos ao isco/ração contendo a vacina, e fornecer dados preliminares sobre o nível de heterogeneidade da imunização com base na variação dos títulos de anticorpos encontrados.
Parceiros: INIAV - UÉ - FMV/ULisboa
Avaliação da duração da proteção imunológica e análise estatística.
Esta atividade tem como objetivo produzir dados sobre quanto tempo dura a proteção.
Os 50% dos animais seropositivos que não serão submetidos ao ensaio de contra-prov virulenta de RHDV2 serão seguidos para avaliar a duração da resposta imunológica. Os títulos de RHDV2-Ab serão determinados pelo teste I-ELISA e HI.
Serão avaliados estaticamente os dados referentes aos títulos de anticorpos induzidos por vacinação oral e ensaios de contra-prova (Atividades 5 e 6), a duração da proteção serológica induzida pela vacina (Atividade 7), bem como as diferenças entre os vários grupos de animais.
O objetivo da Atividade 7 é avaliar a duração da resposta imunológica induzida pela vacina, para prever o intervalo de vacinação.
Parceiros: INIAV
Divulgação de resultados e pedido de patente.
Os resultados do projeto Fight-two serão comunicados ao público, incluindo investigadores, professores, estudantes, jornalistas de ciências, veterinários, conservacionistas, caçadores e cidadãos em geral. Vários meios de comunicação serão utilizados, nomeadamente a Internet, a imprensa e outros meios de comunicação, exposições, bem como conferências e painéis de discussão.
A propriedade intelectual gerada pelo projeto será submetida para pedido de patente provisória e para o INPI (Instituto Nacional de Patentes Industriais).
O objetivo da Atividade 8 é a divulgação dos resultados gerados pelo projeto Fight-two e o registro de patentes do protótipo da vacina oral.
Parceiros: INIAV - IBET - UÉ - FMV/ULisboa
