O principal desafio para a equipa de investigação do projeto REMIRUCULA é a necessidade de melhorar o conhecimento sobre os mecanismos subjacentes à resistência ao míldio na interação D. tenuifolia–Hyaloperonospora sp.,  propondo soluções para o controlo desta doença devastadora. Outro aspeto em estudo é a identificação de genótipos resistentes e parcialmente resistentes ao míldio, que atrasam a progressão da doença e são frequentemente fontes de resistência mais duráveis.

A estratégia adotada inclui uma abordagem multidisciplinar e complementar, envolvendo diferentes grupos de investigação, em estreita colaboração com um produtor de hortícolas de grande relevância nacional. 

Responsabilidade: INIAV (Braga e Oeiras)

Objetivo específico da Atividade 1:

1.1. Constituição de uma coleção de sementes de rúcula selvagem (Diplotaxis tenuifolia) e de isolados de Hyaloperonospora sp.

  • Organizou-se uma coleção com 180 amostras de rúcula de diversas proveniências: i) bancos de germoplasma (Alemanha, Austrália, Áustria, Hungria e Israel), ii) empresas de sementes (CN SEEDS – Reino Unido, ENZA ZADEN – Espanha e ISI SEMENTI S.P.A. – Itália), iii) produtores de rúcula (Vitacress – Portugal e Duncan Family Farms - EUA), iv) comércio local, e v) colheitas de campo em Portugal continental.
  • Realizaram-se quatro missões de prospeção e colheita de sementes nas regiões norte e centro de Portugal. As missões decorreram no período de maio a julho de 2019 e abrangeram 3 sub-regiões: i) Litoral Norte Minhoto e Costa Nova (RUC–1-2019); ii) Trás-os-Montes e Beira Alta (RUC–2-2019); e iii) Beira Baixa e Alto Alentejo (RUC–3-2019). Obtiveram-se 27 amostras de rúcula dos géneros Diplotaxis e Eruca, estando os locais de colheita devidamente identificados por coordenadas GPS. Após o processamento das amostras (secagem, seleção e limpeza) as sementes integraram a coleção de rúcula. Posteriormente as amostras foram semeadas em ambiente protegido para multiplicação dos lotes de sementes e identificação com base nos caracteres morfológicos.
  • Todas as entradas que compõem a coleção têm um número de registo e estão associadas a uma base de dados que integra toda a informação disponível sobre as amostras.
  • A coleção é composta por 140 amostras  Diplotaxis tenuifolia (rúcula selvagem), sendo as restantes Diplotaxis sp  e Eruca spp. (rúcula cultivada). As amostras provenientes das colheitas realizadas em Portugal continental estão em fase de identificação.
  • Organizou-se uma coleção constituída por 20 isolados de Hyaloperonospora sp. colhidos em plantas infetadas no campo na região do Alentejo. Os isolados obtidos em diferentes datas são provenientes da variedade Diplotaxis tenuifolia, e após processamento laboratorial (inoculação, isolamento e multiplicação) encontram-se conservados a -18 °C.
  • Continua a decorrer a colheita de novos isolados de Hyaloperonospora sp. que integrarão a coleção.

Responsabilidade: INIAV (Oeiras)

Objetivos específicos da Atividade 2:

2.1. Desenvolver um protocolo de avaliação da resistência ao míldio na rúcula em ambiente controlado

  • O protocolo de testagem da resistência ao míldio define a metodologia de avaliação das plantas jovens de rúcula e as condições ótimas para o estabelecimento da infeção desta interação planta-patogénio: i) plantas (sementeira e idade), ii) condições de crescimento (temperatura dia/noite, humidade relativa, fotoperíodo, tipo e intensidade de luz), e iii) método de avaliação (metodologia de inoculação, concentração do inóculo, duração das diferentes etapas e escala de avaliação).

2.2. Fenotipagem da coleção de germoplasma de rúcula quanto à resistência ao míldio

  • Realizou-se a avaliação da resistência ao míldio de 180 amostras de rúcula em 3-4 repetições. Dependendo do poder germinativo e do número disponível de sementes, avaliaram-se 40 a 60 plantas por amostra, registando-se individualmente a infeção dos cotilédones e das duas primeiras folhas. As amostras foram agrupadas de acordo com o seu nível de resistência ao míldio, permitindo uma visão global da suscetibilidade da coleção de rúcula.Alguns resultados preliminares foram apresentados no “International Meeting of the Portuguese Society of Genetics”, em 23-24 de janeiro 2020, na Universidade do Algarve, sob a forma de painel.
  • Ao longo do período experimental selecionaram-se plantas resistentes e suscetíveis para multiplicação de semente e utilização nos ensaios seguintes.

2.3. Caracterização ao nível histológico e celular de genótipos de rúcula com diferentes respostas ao míldio

  • O protocolo para análise histológica das plantas de rúcula infetadas com Hyaloperonospora sp. está a ser otimizado. Os resultados disponíveis demonstram que a entrada do patogénio se efetua pela página superior da folha, com o desenvolvimento intercelular do micélio nas folhas. Os genótipos de rúcula resistentes formam rapidamente zonas de necrose acastanhadas que impedem o posterior desenvolvimento do patogénio. No caso de genótipos suscetíveis, apesar de haver formação de algumas necroses, o patogénio completa o seu ciclo de vida com a formação de esporulação de Hyaloperonospora sp. na página inferior das folhas.
  • A partir dos resultados da avaliação da coleção de rúcula (atividade 2.2) serão escolhidas plantas resistentes ao míldio para análise dos lípidos e verificação dos efeitos da presença do patogénico na componente lipídica.

Responsabilidade: INIAV (Oeiras)

Objetivo específico da Atividade 3:

3.1. Testagem da resistência ao míldio de genótipos num produtor de hortícolas “baby leaf” em condições de campo.

  • Após a avaliação da resistência ao míldio da coleção de rúcula realizada em condições de ambiente controlado (atividade 2.2), selecionaram-se 40 genótipos de rúcula selvagem para serem testados na fase adulta em sistema de produção biológico.
  • As diferentes amostras foram semeadas nas Estufas de Experimentação do INIAV (Oeiras) em placas de alvéolos, onde cresceram durante 22 dias. Em 15 de outubro de 2021, foram transplantadas num politúnel na empresa Vitacress Portugal, SA em Odemira.
  • Semanalmente, as plantas foram acompanhadas individualmente no campo com o registo da entrada em floração e do aparecimento de sinais de míldio nas folhas.
  • Após a avaliação das plantas, em 3.12.2021, foi efetuado um corte das folhas e, após 16 dias de recrescimento, as amostras foram avaliadas quanto às características agronómicas (vigor, hábito da planta, recorte da folha).
  • Os resultados obtidos serão apresentados na publicação “Downy mildew evaluation in wild rocket genotypes [Diplotaxis tenuifolia (L.) DC.] under field and controlled condition” a apresentar ao Congresso Internacional de Horticultura (IHC-2022) a realizar em Angers (França), de 14 a 20 de agosto de 2022.

Responsabilidade: UAlg

Objetivo específico da Atividade 4:

4.1. Caracterização molecular de genótipos de rúcula selvagem (D. tenuifolia)

  • O DNA genómico de 100 amostras (~ 10 plantas por amostra) foi extraído e preparado para análise de marcadores moleculares. 
  • Para colmatar a falta de informação genómica em D. tenuifolia e a consequente falta de ferramentas específicas para análises (por exemplo, marcadores de DNA específicos, não aleatórios) foi implementado um programa de sequenciação de próxima geração que teve como resultados:
  1. Montagem do genoma (UALg DiploT.01) (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/assembly/GCA_014822095.1/)
  2. A SRX8354034 foi alocada no ncbi contendo todas as leituras deste projeto: 105,7 milhões de leituras, 15,3 Giga bases (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/?term=SRX8354034)
  3. Identificação e envio para bancos de dados públicos de 500 sequências de microssatélites úteis para o estabelecimento de um número idêntico de marcadores de microssatélites (SSR)
  4. Avaliação de diferentes primers RAPD entre várias amostras. Os primers selecionados vão ser usados para uma análise genética básica de 100 amostras.
  5. Com base nas novas informações genómicas obtidas, foram desenhados primers para 20 marcadores microssatélites, entre os quais 8 marcadores SSR foram validados como responsáveis de produtos de PCR simples e claros. Atualmente esses marcadores estão a ser usados para uma caracterização mais precisa de 100 amostras da coleção de germoplasma e identificação de marcadores ligados a loci de resistência identificados.
  6. Um artigo foi submetido para publicação.

4.2. Caracterização molecular da coleção de isolados de Hyaloperonospora sp.

  • As diferentes populações de isolados de Hyaloperonospora sp. conservados a -18 °C estão a ser multiplicadas num hospedeiro Diplotaxis tenuifolia suscetível e serão analisadas por microssatélites e por sequenciação do genoma.

4.3. Classificação taxonómica de isolados de Hyaloperonospora sp. colhidos na rúcula

  • A caracterização molecular do genoma de Hyaloperonospora sp. permitirá a sua taxonomia e a atribuição do epiteto específico da espécie.

Responsabilidade: ITQB NOVA

Objetivo específico da Atividade 5:

5.1. Estabelecimento de perfis metabolómicos de genótipos de rúcula (D. tenuifolia) total e parcialmente resistentes ao míldio

  • Após a avaliação da resistência ao míldio da coleção de rúcula realizada em condições de ambiente controlado (atividade 2.2), selecionaram-se 8 genótipos de rúcula selvagem resistentes e suscetíveis para caracterização dos perfis metabolómicos.
  • Um total de 80 plantas (10 plantas por amostra) cresceram em vasos de pequena dimensão (9x9x9-cm) durante 28 dias em ambiente controlado.
  • As plantas foram separadas em dois grupos e sujeitas a dois tratamentos (inoculado vs. controlo). No grupo inoculado as plantas foram infetadas por pulverização com uma suspensão de conídios de Hyaloperonospora spp. Decorridos 7 dias após a inoculação, as folhas de cada planta foram colhidas em separado para análise cromatográfica e espectrofotometria gasosa (GC-TOF-MS).
  • No final deste estudo espera-se obter os perfis metabolómicos das diferentes amostras e avaliar o modo como estes metabolitos são afetados pela presença do patogénico.

Responsabilidade: INIAV (Oeiras)

Objetivos específicos da Atividade 6:

6.1 Desenvolvimento de uma plataforma aberta de divulgação das atividades do projeto, dos principais resultados obtidos e ações de divulgação

  • A equipa do projeto, em estreita colaboração com o departamento de informática do INIAV, desenvolveu a presente plataforma online (https://projects.iniav.pt/REMIRucula) alocada na página de internet do INIAV, para divulgar a informação mais relevante relativa ao desenvolvimento do projeto REMIRUCULA.

6.2. Organização de um workshop e um seminário técnico-científico

  • No início do projeto foi realizado o kick-off que reuniu todos os membros do projeto REMIRUCULA, tendo sido enunciadas e discutidas as diferentes atividades a realizar no âmbito do projeto e o modo de coordenação dessas atividades.
  • Devido aos constrangimentos resultantes da pandemia COVID-19, os contactos entre os membros da equipa do projeto têm-se realizado virtualmente.

6.3. Coordenação da transferência do conhecimento científico e da constituição de um banco de dados curado e de uma possível patente

  • Os resultados obtidos têm sido apresentados em diversas reuniões científicas, na forma de painel, e publicados em revistas com arbitragem científica e de divulgação. Também têm sido apresentados em eventos junto do grande público, como por exemplo “A noite dos Investigadores”, plataforma do GREEN-IT (atividade 6.4).

6.4. Implementação das atividades de divulgação junto do público alvo – agricultores, indústria, decisores políticos – e do público em geral

  • A 27 de setembro de 2019, a equipa do projeto REMIRUCULA do INIAV participou na Noite Europeia dos Investigadores (NEI 2019) que decorreu no Museu Nacional de História Natural e Ciência (MUHNAC-UL), no Príncipe Real, em Lisboa. A atividade consistiu na apresentação de um painel e um roll-up sobre a “A Importância da Rúcula na Dieta Mediterrânea” para familiarizar os consumidores, e o público em geral, sobre a produção de hortícolas baby-leaf e os benefícios para a saúde.
  • A 23-24 de janeiro de 2020, foi apresentada uma comunicação em forma de painel intitulada “Establishment of a wild rocket (Diplotaxis tenuifolia) germplasm collection and its preliminary assessment for downy mildew resistance and genetic diversity” no encontro “International Meeting of the Portuguese Society of Genetics (IMPSG)” que decorreu na Universidade do Algarve em Faro.
  • Foi publicado um artigo de divulgação na revista Vida Rural (Coelho P.S., Pereira A.L., Carranca C., Scotti P., Lopes V., Boto C., Reis J., Leitão J. 2021. Míldio na rúcula selvagem – o porquê de investigar esta doença. Vida Rural 1867:44-50. https://www.researchgate.net/publication/352769754).
  • Foi publicado um artigo de divulgação na revista Voz do Campo (Paula S. Coelho, Ana L. Pereira, Corina Carranca, Paula Scotti, Carlos Gaspar, Violeta Lopes, José Leitão. 2021. O míldio é um problema grave na produção de rúcula selvagem (Diplotaxis tenuifolia L.). Voz do Campo 249: 40-42. https://www.researchgate.net/publication/352466011).
  • A 1-2 de julho de 2021, foram apresentadas três comunicação em forma de painel no “II International Meeting of the Portuguese Society of Genetics (IMPSG)” que decorreu on-line na Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro em Vila Real.
  • A 24 de setembro de 2021, a equipa do projeto REMIRucula do INIAV participou na Noite Europeia dos Investigadores (NEI Oeiras 2021) que decorreu na Marina de Oeiras, em Oeiras. A atividade consistiu na apresentação da cultura de rúcula (flor, síliquas e sementes), um painel com exemplos de baby leaves, um roll-up sobre “A Importância da Rúcula na Dieta Mediterrânea”, e divulgação dos resultados preliminares obtidos no âmbito do projeto, designadamente a identificação de acessos mais resistentes à doença do míldio. Pretendeu-se familiarizar os consumidores sobre os benefícios da hortícola para a saúde humana e alertar para a doença causada pelo oomiceta Hyaloperonospora sp..

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