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Atividades

O principal desafio para a equipa de investigação do projeto REMIRUCULA é a necessidade de melhorar o conhecimento sobre os mecanismos subjacentes à resistência ao míldio na interação D. tenuifolia–Hyaloperonospora sp.,  propondo soluções para o controlo desta doença devastadora. Outro aspeto em estudo é a identificação de genótipos resistentes e parcialmente resistentes ao míldio, que atrasam a progressão da doença e são frequentemente fontes de resistência mais duráveis.

A estratégia adotada inclui uma abordagem multidisciplinar e complementar, envolvendo diferentes grupos de investigação, em estreita colaboração com um produtor de hortícolas de grande relevância nacional. 

Responsabilidade: INIAV (Braga e Oeiras)

Objetivo específico da Atividade 1:

1.1. Constituição de uma coleção de sementes de rúcula selvagem (Diplotaxis tenuifolia) e de isolados de Hyaloperonospora sp.

  • Organizou-se uma coleção com 182 amostras de rúcula de diversas proveniências: i) bancos de germoplasma (Alemanha, Austrália, Áustria, Hungria e Israel), ii) empresas de sementes (CN SEEDS – Reino Unido, ENZA ZADEN – Espanha e ISI SEMENTI S.P.A. – Itália), iii) produtores de rúcula (Vitacress – Portugal e Duncan Family Farms - EUA), iv) comércio local, e v) missões de colheita no campo em Portugal continental.
  • Realizaram-se quatro missões de prospeção e colheita de sementes nas regiões norte e centro de Portugal. As missões decorreram no período de maio a julho de 2019 e abrangeram 3 sub-regiões: i) Litoral Norte Minhoto e Costa Nova (RUC–1-2019); ii) Trás-os-Montes e Alto Douro e Beira Alta (RUC–2-2019); e iii) Beira Baixa e Alto Alentejo (RUC–3-2019). Obtiveram-se 27 amostras estando os locais de colheita devidamente identificados por coordenadas GPS. Após o processamento das amostras (secagem, seleção e limpeza) as sementes integraram a coleção de rúcula. Posteriormente as amostras foram semeadas em ambiente protegido para identificação com base nos caracteres morfológicos e multiplicação dos lotes de sementes.
  • As 182 entradas que compõem a coleção têm um número de registo e estão associadas a uma base de dados que integra toda a informação disponível sobre as amostras. Esta coleção é composta por 132 amostras Diplotaxis tenuifolia (rúcula selvagem), sendo as restantes Diplotaxis spp., Eruca (rúcula cultivada) e Brassica spp.
  • Organizou-se ainda uma coleção com 28 isolados de Hyaloperonospora obtidos em diferentes datas em plantas infetadas no campo na região do Alentejo. Todos os isolados foram colhidos na variedade Diplotaxistenuifolia, e após processamento laboratorial (inoculação, isolamento e multiplicação) foram conservados a -18 °C.
  • Continua a decorrer a colheita de novos isolados de Hyaloperonospora que deverão integrar a coleção.

Responsabilidade: INIAV (Oeiras)

Objetivos específicos da Atividade 2:

2.1. Desenvolver um protocolo de avaliação da resistência ao míldio na rúcula em ambiente controlado

  • O protocolo de testagem da resistência ao míldio define a metodologia de avaliação das plantas jovens de rúcula e as condições ótimas para o estabelecimento da infeção nesta interação planta-patogénio: i) plantas (sementeira e idade), ii) condições de crescimento das plantas (temperatura dia/noite, humidade relativa, fotoperíodo, tipo e intensidade de luz), e iii) método de avaliação (metodologia de inoculação, concentração do inóculo, duração das diferentes etapas do processo de infeção e escala de avaliação da resposta das plantas).

2.2. Fenotipagem da coleção de germoplasma de rúcula quanto à resistência ao míldio

  • Avaliou-se a resistência ao míldio das 182 amostras da coleção, em 3 repetições. Dependendo do poder germinativo e do número disponível de sementes, avaliaram-se 40 a 60 plantas por amostra, registando-se individualmente a infeção dos cotilédones e das duas primeiras folhas. As amostras foram agrupadas de acordo com o seu nível de resistência ao míldio, permitindo uma visão global da suscetibilidade da coleção de rúcula.
  • Ao longo do período experimental selecionaram-se plantas resistentes e suscetíveis para multiplicação de semente e utilização nos ensaios seguintes.

2.3. Caracterização ao nível histológico e celular de genótipos de rúcula com diferentes respostas ao míldio

  • Definiu-se o protocolo para análise histológica das plantas de rúcula infetadas com Hyaloperonospora Os resultados demonstram que a entrada do patogénio ocorre pela página superior da folha, com o desenvolvimento intercelular do micélio. Os genótipos de rúcula resistentes formam rapidamente zonas de necrose acastanhadas que impedem o posterior desenvolvimento do patogénio. No caso de genótipos suscetíveis, apesar de haver formação de algumas necroses, o patogénio completa o seu ciclo de vida com a formação de esporulação de Hyaloperonosporasp. na página inferior das folhas.
  • Após a avaliação da coleção de rúcula (atividade 2.2) selecionaram-se as amostras para as análises de lípidos e verificação dos efeitos da presença do patogénio na componente lipídica.

Responsabilidade: INIAV (Oeiras)

Objetivo específico da Atividade 3:

3.1. Testagem da resistência ao míldio de genótipos num produtor de hortícolas “baby leaf” em condições de campo.

  • Após a avaliação da resistência ao míldio da coleção de rúcula realizada em ambiente controlado (atividade 2.2), selecionaram-se 40 genótipos de rúcula selvagem para serem testados na fase adulta em sistema de produção biológico. As diferentes amostras foram semeadas em placas de alvéolos e cultivadas na Estufa de Experimentação do INIAV (Oeiras) durante 22 dias. Em 15 de outubro de 2021 foram transplantadas para um politúnel na empresa Vitacress Portugal, SA, em Odemira.
  • Semanalmente, as plantas foram acompanhadas, individualmente, no campo, com o registo da entrada em floração e do aparecimento de sinais de míldio nas folhas.
  • Após a avaliação final das plantas (3.12.2021) foi efetuado o corte das folhas e após 16 dias de recrescimento, as amostras foram avaliadas quanto às características agronómicas (vigor, hábito da planta, recorte da folha).

Responsabilidade: UAlg

Objetivo específico da Atividade 4:

4.1. Caracterização molecular de genótipos de rúcula selvagem (D. tenuifolia)

  • O DNA genómico de 100 amostras (~10 plantas por amostra) foi extraído e preparado para análise de marcadores moleculares.
  • Para colmatar a falta de informação genómica em tenuifolia e de ferramentas específicas para análises (por exemplo, marcadores de DNA específicos, não aleatórios) foi implementado um programa de sequenciação de próxima geração que teve como resultados:
  1. A montagem do genoma (UALg DiploT.01) (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/assembly/GCA_014822095.1/).
  2. A SRX8354034 foi alocada no ncbi contendo todas as leituras deste projeto: 105,7 milhões de leituras, 15,3 Giga bases (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/?term=SRX8354034).
  3. Identificação e envio para bancos de dados públicos de 500 sequências de microssatélites úteis para o estabelecimento de um número idêntico de marcadores de microssatélites (SSR).
  4. Avaliação de diferentes primers RAPD entre várias amostras. Os primers selecionados foram usados na análise genética básica de 100 amostras.
  5. Com base nas novas informações genómicas obtidas, foram desenhados primers para 20 marcadores microssatélites, entre os quais 8 marcadores SSR validados como responsáveis de produtos de PCR. Os marcadores foram usados para a caracterização mais precisa de 100 amostras da coleção de germoplasma e identificação de marcadores ligados a loci de resistência.

4.2. Caracterização molecular da coleção de isolados de Hyaloperonospora sp.

  • Os diferentes isolados de Hyaloperonospora conservados a -18 °C foram multiplicados num hospedeiro Diplotaxis tenuifolia suscetível e analisados por microssatélites e por sequenciação do genoma.

4.3. Classificação taxonómica de isolados de Hyaloperonospora sp. colhidos na rúcula

  • A caracterização molecular do genoma de Hyaloperonospora permite classificar taxonomicamente e atribuir o epíteto específico da espécie.

Responsabilidade: ITQB NOVA

Objetivo específico da Atividade 5:

5.1. Estabelecimento de perfis metabolómicos de genótipos de rúcula (D. tenuifolia) total e parcialmente resistentes ao míldio

  • Após a avaliação da resistência ao míldio da coleção de rúcula em condições de ambiente controlado (atividade 2.2), selecionaram-se 8 genótipos de rúcula selvagem, resistentes e suscetíveis, para caracterização dos perfis metabolómicos.
  • Um total de 80 plantas (10 plantas por amostra) cresceram em vasos de pequena dimensão (9x9x9 cm), durante 28 dias, em ambiente controlado.
  • As plantas foram separadas em dois grupos e sujeitas a dois tratamentos (inoculado vs. controlo). No grupo inoculado, as plantas foram infetadas por pulverização com uma suspensão de conídios de Hyaloperonospora Decorridos 7 dias, as folhas de cada planta foram colhidas separadamente para análise cromatográfica e espectrofotometria gasosa (GC-TOF-MS).
  • Obtiveram-se os perfis metabolómicos das diferentes amostras e avaliou-se o modo como estes metabolitos foram afetados pela presença do patogénio.

Responsabilidade: INIAV (Oeiras)

Objetivos específicos da Atividade 6:

6.1 Desenvolvimento de uma plataforma aberta de divulgação das atividades do projeto, dos principais resultados obtidos e ações de divulgação

  • A equipa do projeto, em estreita colaboração com o departamento de informática do INIAV, desenvolveu a presente plataforma online (https://projects.iniav.pt/REMIRucula) nos primeiros 6 meses do projeto, alocada na página de internet do INIAV e atualizada regularmente, para divulgar a informação mais relevante relativa ao desenvolvimento do projeto REMIRucula.

6.2. Organização de um workshop e um seminário técnico-científico

  • No início do projeto realizou-se o kick-off que reuniu os membros do projeto REMIRucula, tendo sido enunciadas e discutidas as diferentes atividades a realizar no âmbito do projeto e o modo de coordenação dessas atividades.
  • Realizou-se um seminário técnico-científico no final do projeto, em 4.12.2022, na Universidade do Algarve.

6.3. Coordenação da transferência do conhecimento científico e da constituição de um banco de dados curado e de uma possível patente

  • Para além da plataforma do projeto, os resultados obtidos têm sido apresentados em diversas reuniões científicas, na forma de painel, e publicados em revistas com arbitragem científica e de divulgação. Também têm sido divulgados em diversos eventos, junto do grande público.

6.4. Implementação das atividades de divulgação junto do público alvo – agricultores, indústria, decisores políticos – e do público em geral

  • Em 27 de setembro de 2019, a equipa do projeto REMIRucula do INIAV participou na “Noite Europeia dos Investigadores (NEI 2019)” que decorreu no Museu Nacional de História Natural e Ciência (MUHNAC-UL), no Príncipe Real, em Lisboa. A atividade consistiu na apresentação de um painel e um roll-up sobre a “A Importância da Rúcula na Dieta Mediterrânea” e teve como objetivo familiarizar os consumidores, e o público em geral, sobre a produção de hortícolas baby-leaf, em Portugal, e os benefícios para a saúde.
  • Em 23-24 de janeiro de 2020, foi apresentada uma comunicação em forma de painel no encontro “International Meeting of the Portuguese Society of Genetics (IMPSG)” que decorreu na Universidade do Algarve, Faro, Portugal (https://researchgate.net/publication/339973853).
  • Publicação de um artigo na revista Vida Rural (Coelho P.S., Pereira A.L., Carranca C., Scotti P., Lopes V., Boto C., Reis J., Leitão J. 2021. Míldio na rúcula selvagem – o porquê de investigar esta doença. Vida Rural 1867: 44-50. https://www.researchgate.net/publication/352769754).
  • Publicação de um artigo na revista Voz do Campo (Paula S. Coelho, Ana L. Pereira, Corina Carranca, Paula Scotti, Carlos Gaspar, Violeta Lopes, José Leitão. 2021. O míldio é um problema grave na produção de rúcula selvagem (Diplotaxis tenuifolia). Voz do Campo 249: 40-42. https://www.researchgate.net/publication/352466011).
  • Publicação de um capítulo no livro “Advances in Plant Breeding Strategies: Vegetable Crops” editado pela Springer (https://doi.org/10.1007/978-3-030-66969-0).
  • Em 1-2 de julho de 2021, foram apresentadas três comunicações, em forma de painel, no “II International Meeting of the Portuguese Society of Genetics (IMPSG)” que decorreu on-line na Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro, em Vila Real, Portugal.
  • Em 24 de setembro de 2021, a equipa do projeto REMIRucula do INIAV participou na “Noite Europeia dos Investigadores (NEI Oeiras 2021)” que decorreu na Marina de Oeiras, Portugal. A atividade consistiu na apresentação da cultura da rúcula, um painel com exemplos de baby-leaves, um roll-up sobre “A Importância da Rúcula na Dieta Mediterrânea”, e a divulgação de resultados obtidos no âmbito do projeto, designadamente a identificação de acessos resistentes à doença do míldio. Pretendeu-se informar os consumidores sobre os benefícios do consumo da hortícola para a saúde humana e alertar para a doença causada pelo oomiceta Hyaloperonospora
  • Em 27-28 de junho de 2022, foram apresentadas duas comunicações em forma de painel no “III International Meeting of the Portuguese Society of Genetics (IMPSG)” que decorreu na Universidade de Évora, Portugal.
  • Publicação de um artigo científico na revista Agronomy Journal (Coelho P.S., Reis J.M., Pereira A.L., Vairinhos A., Lopes V., Leitão J.M. 2022. Downy mildew resistance and genetic variability in a wild rocket germplasm collection. Agronomy Journal 114(6): 3083–3095. https://doi.org/10.1002/agj2.21190).
  • Em 17 de agosto de 2022, foi apresentada uma comunicação em forma de painel com apresentação oral no “XXXI International Horticultural Congress: IHC2022” (Coelho P.S., Pereira A.L., Reis J., Carranca C., Lopes V.R., Leitão J.M. 2022. Downy mildew evaluation in wild rocket genotypes [Diplotaxis tenuifolia (L.) DC.] under field and controlled conditions. Poster apresentado no XXXI International Horticultural Congress: IHC2022 ao "International Symposium on Sustainable Control of Pests and Diseases", Angers, França, 14-20 de agosto. https://www.researchgate.net/publication/363021869)
  • Em 6 de setembro de 2022, foi apresentada uma comunicação em forma de painel no “XII Encontro Internacional de Fitossociologia”, na Escola Superior Agrária de Castelo Branco, Portugal (Gaspar C., Lopes V., Figueiredo P., Coelho P., Leitão J. 2022. Colheita e conservação de parentes selvagens de espécies cultivadas (CWR) de brássica. Book of abstracts, pp. 110-111. ISBN 978-989-333734. https://www.researchgate.net/publication/363885649).
  • Em 8 de setembro de 2022, foi apresentada uma comunicação em forma de painel no “2nd Nordic Metabolomics Conference 2022”, em Copenhaga, Dinamarca (Rodrigues A.M., Pereira A.L., Coelho P.S., António C. 2022. Primary metabolite profiling of wild rocket Diplotaxis tenuifolia accessions with differential responses to downy mildew disease. Book of abstracts, pp. 37-38. https://www.researchgate.net/publication/363885650).
  • Publicação de um artigo científico nas Atas do “XXXI International Horticultural Congress: IHC2022” (Coelho P.S., Pereira A.L., Reis J., Carranca C., Lopes V.R., Leitão J.M. 2022. Downy mildew evaluation in wild rocket genotypes [Diplotaxis tenuifolia (L.) DC.] under field and controlled conditions. Angers, França, 14-20 de agosto. Acta Horticulturae (aceite para publicação em 11.06.2022).
  • Em 14 de outubro de 2022, a equipa do projeto REMIRucula do INIAV participou no “Festival Internacional de Ciência - FICA”, Oeiras, Portugal.
  • Em 4 de novembro de 2022, realizou-se o “Seminário de Apresentação dos Resultados Finais do Projeto REMIRucula” na Universidade do Algarve, em Faro, Portugal, com a presentação de 6 comunicações orais por membros do projeto e 2 por convite.
  • Publicação de um artigo científico na revista Plants (Reis J.M., Pereira R.J., Coelho P.S., Leitão J.M. 2022. Assessment of wild rocket (Diplotaxis tenuifolia (L.) DC.) germplasm accessions by NGS identified SSR and SNP markers. Plants 11(24): 3482. https://doi.org/10.3390/plants11243482).